从原料中抽提得到的蛋白质溶液一般蛋白质含量较低,并含有多种杂质。对抽提液进行初步提取,也称粗提或粗分级,主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白,并将蛋白浓缩。这一步的操作一般应该尽量简单快速,并且适于处理大量样品,所以以沉淀法为主,包括简单沉淀、分级沉淀等。
简单沉淀是一次性完成,分级沉淀是分次加入沉淀剂,使不同的蛋白质在不同沉淀剂浓度下分别沉淀,从而被分离开来。一般沉淀核酸、多糖等杂质都是简单沉淀,比如MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素等核酸沉淀剂。
分离蛋白一般会尽量避免变性因素,以保证目的蛋白的生物活性。但如果目的蛋白对某种变性因素抗性较强,也可以选择性地变性杂蛋白,从而实现快速纯化目的。例如提取卵黏蛋白时,因为其对酸的稳定性较高,所以可用2.5%三氯乙酸处理,使绝大多数杂蛋白变性沉淀。
分级沉淀法常用盐析或有机溶剂分级沉淀。这两种方法都可以简单快速地将总蛋白分成几组,从而起到纯化作用,所以是生化中分级沉淀经常采用的方法。其中盐析法不易引起蛋白变性,更为常用。
盐析是在溶液中加入大量中性盐,中和蛋白质表面电荷,破坏蛋白质水化层,从而使蛋白质沉淀。盐析一般在蛋白质的等电点进行,因为此时蛋白溶解度最小。最常用的盐是硫酸铵,其浓度一般用饱和溶液的百分数表示。因为加入硫酸铵时,溶液体积会有很大的非线性变化,不易计算,所以有人测定了溶液从某一浓度到另一浓度应加入的盐量,制成表格,便于使用。
硫酸铵饱和度表
盐析后样品中含大量盐类,通常不利于后续实验,要设法除去。实验室中常用透析或分子筛层析(如Saphadex G25)除盐。如果样品浓度过低,可用反透析、冻干、超滤等方法浓缩。
层析设备
初步提取得到的制剂一般可直接用于工业生产。科研一般需要高纯度样品,需要进一步精制。常用方法主要是各种层析、电泳,有时也采用结晶法。
电泳分离蛋白质
除结构分析需要晶体外,结晶也是蛋白质纯度高、构象正确的重要标志。因为蛋白质结晶过程需要其结构均一,所以变性蛋白是无法结晶的。因此,虽然蛋白结晶不能出去所有杂质,但可以除去构象异常的分子,这是其它方法难以做到的。
蛋白质晶体,引自IUCrJ. May 1; 6(Pt 3): 454–464. (g) hmDRS, (h) OMT ShuA. 标尺长度为 0.1 mm