6月29日,Nature Biotechnology杂志在线发表了中科院遗传发育所高彩霞研究组的题为“Precise, Predictable Multi-nucleotide Deletions in Rice and Wheat Using APOBEC–Cas9”的研究论文，建立了新型的多核苷酸靶向删除系统（APOBEC-Cas9 fusion-induced deletion systems, AFIDs），并成功在水稻和小麦基因组中实现了精准、可预测的多核苷酸删除。AFID系统具有高效、精准、可预测等优势，因此该系统的建立可为植物基因组调控DNA的功能研究及设计育种提供了一个强有力的基因组编辑工具。该研究组基于胞嘧啶脱氨以及碱基切除修复（Base Excision Repair, BER）原理，首次将野生型SpCas9与胞嘧啶脱氨酶APOBEC、尿嘧啶糖基化酶(UDG)以及无嘌呤嘧啶位点裂合酶（AP lyase）组合，建立了新型的多核苷酸靶向删除系统（APOBEC-Cas9 fusion-induced deletion systems, AFIDs），并成功在水稻和小麦基因组中实现了精准、可预测的多核苷酸删除。考虑植物细胞本身存在BER体系，该研究组首先利用高脱氨活性的APOBEC3A脱氨酶构建出3种形式的AFID系统（AFID-1~3），并在水稻和小麦细胞中对多个内源DNA靶点进行测试，结果显示AFID-3介导的删除效率高达33.1%, 且产生从不同的5’-胞嘧啶到Cas9切割位点间的多核苷酸删除，可预测的删除比例高达30%以上。研究人员进一步对不同胞嘧啶脱氨酶进行筛选，发现截断的APOBEC3B脱氨酶（A3Bctd）不仅有较高的脱氨活性，同时还具有一个更窄的脱氨窗口。将A3Bctd替换AFID-3系统中的A3A，从而开发出eAFID-3系统。eAFID-3更高效地介导从偏好TC基序的脱氨位点到Cas9 切割位点之间的可预测删除，效率是AFID-3的1.5倍。此外，研究组利用AFID-3系统靶向水稻OsSWEET14基因启动子上的效应子结合元件，获得了多核苷酸删除的突变体植株，经白叶枯病接种试验发现：相较于1~2 bp的插入缺失，该系统产生的多核苷酸删除水稻突变体对白叶枯病菌的抗性更强。
图：AFID系统在植物中介导精准且可预测多核苷酸删除。(a) AFID系统工作原理示意图。(b) AFID系统的不同构建形式(AFID-1~3、eAFID-3)。(c) AFID-3与Cas9之间可预测删除比例的比较。(d) AFID-3与eAFID-3可预测删除类型的比较。(e) AFID-3介导的水稻可预测多核苷酸删除突变体与1~2 bp插入缺失突变在白叶枯病抗性上的差异。Precise, Predictable Multi-nucleotide Deletions in Rice and Wheat Using APOBEC–Cas9Shengxing Wang, Yuan Zong, Qiupeng Lin, Huawei Zhang, Zhuangzhuang Chai, Dandan Zhang, Kunling Chen, Jinlong Qiu and Caixia Gao
Abstract
Short insertions and deletions can be produced in plant genomes using CRISPR–Cas editors, but reliable production of larger deletions in specific target sites has proven difficult to achieve. We report the development of a series of APOBEC–Cas9 fusion-induced deletion systems (AFIDs) that combine Cas9 with human APOBEC3A (A3A), uracil DNA-glucosidase and apurinic or apyrimidinic site lyase. In rice and wheat, AFID-3 generated deletions from 5′-deaminated Cs to the Cas9-cleavage site. Approximately one-third of deletions produced using AFID-3 in rice and wheat protoplasts (30.2%) and regenerated plants (34.8%) were predictable. We show that eAFID-3, in which the A3A in AFID-3 is replaced with truncated APOBEC3B (A3Bctd), produced more uniform deletions from the preferred TC motif to the double-strand break. AFIDs could be applied to study regulatory regions and protein domains to improve crop plants.
原文链接：/10.1038/s41587-020-0566-4
