胰腺癌，因其难以早期发现且高致死率，被称为“癌症之王”。在许多组织中，致癌基因在组织干细胞中的激活，往往导致其癌变。但是相对于其它类型的组织来说，正常的胰腺细胞却很难被突变的Kras致癌基因所转化，即使超过90%的人类胰腺癌携带Kras基因突变【1,2】。之前的研究发现，胰腺导管癌的产生往往伴随着严重的胰腺炎的出现，且由于Kras致癌基因的激活，与抑癌基因Cdkn2a,Trp53,和Smad4的缺失，携带胰腺炎的小鼠更容易发展成胰腺癌【3】。
目前的研究发现，通过雨蛙素（一种肠促胰酶肽类似物）可以诱导小鼠产生急性胰腺炎，伴随着胰腺炎的产生，正常的胰腺腺泡细胞转化成导管形状的细胞，这种转化被称为acinar-to-ductal metaplasia(ADM)。在没有Kras基因突变的情况下，停止雨蛙素注射两周左右，胰腺的形态会恢复成正常的样子。但是如果小鼠携带Kras突变，胰腺中会出现大量的pancreatic intraepithelial neoplasia(PanIN)，一种普遍认为的胰腺癌前体细胞【4】。那么在胰腺癌的发展早期，Kras致癌基因是如何与胰腺炎联系，来共同促进胰腺癌的发生与发展的呢，这一联系目前还没有得到充分的研究。
Kras致癌基因除了在胰腺癌的发展早期非常重要，在胰腺癌阶段，甚至是转移的过程中都起到了非常重要的作用。目前的研究发现，Kras基因能够调控胰腺癌中大量的代谢通路和对胰腺癌的生存，增值所必须的信号通路【5】。鉴于Kras基因在胰腺癌的发展各个阶段都非常重要，那么Kras调控的转录网络是否在胰腺癌的早期就已经出现了呢。
近日，清华大学Charles David组，北京协和医院赵玉沛、吴文铭组合作在Nature Cancer发表了题为Mutant Kras co-opts a proto-oncogenic enhancer network in inflammation-induced metaplastic progenitor cells to initiate pancreatic cancer的研究论文，在该项研究中，作者首次系统地阐述了，胰腺癌前体细胞的转录组与表观遗传组信息，并阐明了Kras突变基因通过协同调控胰腺炎诱导的转录网络，来促进胰腺癌的产生与发展。为胰腺癌早期的诊断与治疗，提供了潜在的靶点和思路。
为了研究Kras突变基因对胰腺癌的发展早期转录组与表观遗传组的影响，作者找到了Klf5转录因子作为一种marker，来进行胰腺癌早期细胞的分选。之前的研究表明，Klf5作为人类胰腺癌中高表达的转录因子之一，在正常的胰腺导管细胞与ADM中出现，进而广泛地表达在panIN与胰腺癌细胞中【6】。所以作者假设，可能Klf5表达的ADM细胞是胰腺癌的前体细胞。
为了验证Klf5表达的ADM细胞是否为胰腺癌前体细胞。首先作者构建了Klf5－mCherry-CreERT2;LSL－YFP小鼠模型，利用TAM去激活正常导管细胞中的Cre酶，或者通过雨蛙素的注射，诱导Klf5表达的ADM细胞，同时利用TAM激活ADM中的Cre酶。Cre酶的激活导致了LSL-YFP的切割，使YFP荧光蛋白表达。通过追踪YFP表达的细胞，并将其通过流式细胞仪分选成单细胞。进而进行了单细胞转录组的分析，确定了表达YFP细胞的特定状态。不同时间点的单细胞转录组数据表明，同正常的导管细胞比较（NT,D14），Klf5表达的ADM细胞随着炎症的消失，转变成了腺泡细胞（图一b,c）。而表达Klf5的正常导管细胞却几乎没有改变（图一b,c）。这些数据表明，Klf5表达的ADM细胞具有分化的能力。其次作者构建了Klf5－mCherry-CreERT2;LSL－KrasG12D;LSL-Cdkn2afl/fl小鼠模型，通过雨蛙素的注射，诱导Klf5表达的ADM细胞的产生。同时通过tamoxifen（TAM）激活这群细胞中的Cre酶，来诱导KrasG12D基因的转录与Cdkn2a肿瘤抑制基因的缺失，确定Klf5表达的ADM细胞最终能够发展成胰腺癌(图一, a)。作者将这群被胰腺炎诱导产生，进而被Kras突变基因所维持，具备发展成胰腺癌的能力的ADM细胞称之为pancreatic duct-like progenitor cells(PDLP cells)。为了比较PDLP细胞与正常的胰腺导管细胞在转录组上的区别，利用雨蛙素诱导Klf5－mCherry-CreERT2小鼠产生PDLP细胞群，通过少量细胞RNA-seq技术，将它与正常的胰腺导管细胞进行比较。发现对胰腺癌的发展非常重要的代谢通路，增值信号与其它信号通路在PDLP细胞群中就已经出现。如果小鼠不携带Kras突变，大约在注射雨蛙素七天之后，胰腺接近恢复正常，这些信号通路也会随之下调。但当小鼠携带Kras基因突变，停止注射雨蛙素，PDLP细胞也会被维持，进而向panIN方向发展，这些在PDLP中上调的信号通路也被维持（图一, d）。通过分析peng et al. 的人类胰腺癌单细胞RNA-seq数据，作者发现在大量在PDLP中上调的基因于人类胰腺癌也是高表达的。这些实验数据表明，Kras突变能够维持胰腺炎诱导产生的信号通路，来促进人类胰腺癌的发生发展。为了探究Kras突变基因是如何调控PDLP中转录组的，作者利用相同的小鼠模型与药物处理方式，分选出PDLP细胞，通过少量细胞的ATAC-seq技术，来研究PDLP的染色质开放程度。将PDLP与正常的胰腺导管细胞进行比较发现，PDLP中大量高激活基因的附近，其染色质也变得更加开放。这种开放的染色质区域也会随着炎症的消失而下调，但是会被Kras突变基因所维持与增强（图一, e）。通过与H3K27ac，H3K4me ChIP-seq数据进行比较发现，这些被Kras突变体所维持的染色质开放区域更多地富集在基因组的enhancer区域。
图一，Kras信号通过维持染色质的开放程度参与到炎症调控的转录网络中来，进而促进PDLP的维持。
Kras作为上游的信号因子，调控非常多的信号通路来促进基因的转录。作者将被Kras突变体维持的，在PDLP中开放的染色质区域，进行了转录因子的motif search。发现AP1,Ets，Fox，Klf转录因子家族的motif在此区域进行了富集（图二，b）。这暗示了这些转录因子家族可能参与到Kras调控的PDLP转录调控网络中来。同时吴文铭组彭俊雅博士将病人胰腺癌样本与导管细胞进行了单细胞ATAC-seq测序，在PDAC中发现了与PDLP中类似的开放区域（图二，a）。将病人胰腺癌中高开放的区域进行motif search。发现AP1,Ets，Fox，Klf转录因子家族的motif也在此区域进行了富集（图二，c）。这暗示了在PDLP中开放的区域，在病人PDAC是保守开放的。
图二，a, 病人胰腺癌样本与正常导管细胞的染色质开放程度比较 b, 小鼠K-LOCKEDOPEN 染色质区域的转录因子motif分析c, 病人hPDAOPEN染色质区域的转录因子motif分析
考虑到Kras突变基因对癌细胞生存的重要性，作者在小鼠癌细胞系中利用CRISPR技术，进行了在人类胰腺癌中高表达的转录因子的筛选。研究发现，敲除掉AP1家族中的Fosl1，Junb,，Klf家族中的Klf5与Fox家族中的Foxa2，都对胰腺癌的生存产生了阻碍（图三，a）。为了探究Junb，Fosl1，Klf5,与Foxa2在胰腺癌的发展早期的作用，作者利用adeno-associated virus serotype（携带Cdkn2a,Trp53,和Smad4这三个在胰腺癌中高突变的肿瘤抑制基因的sgRNA与目标转录因子的sgRNA）去分别敲除掉这几个转录因子。跟对照组的PDAC相比，敲除掉Junb，Fosl1和Klf5后，小鼠胰腺大部分处于正常形态（图三，b）。且其Kras调控的转录组与表观遗传组与对照组比较，也极大地被下调。这些数据表明了，在胰腺癌的发展的早期，Junb，Fosl1与Klf5参与到Kras调控的转录网络中来，促进癌症的发生发展。
图三，a,利用CRISPR技术筛选对胰腺癌细胞生存所必须的转录因子。b, 利用AAV技术在小鼠体内敲除掉转录因子，观察其对胰腺癌的发展的影响。
作者利用chromatin enrichment for proteomics(ChEP)，WB发现，Junb与Fosl1蛋白稳定性直接受KrasG12D的调控。但是Klf5与Foxa2的转录，翻译，核定位都不直接受KrasG12D的调控。但是通过RNA-seq分析，作者发现，Klf5，Foxa2与KrasG12D调控相似的基因网络（图四，a）。暗示了Junb，Fosl1作为Kras下游的转录因子与Klf5和Foxa2一起，促进Kras调控的转录网络的形成。利用Tet-on KrasG12D胰腺癌细胞系，作者进行了Klf5的ChIP-seq，发现在有Kras的条件下，Klf5与Foxa2更倾向结合到Kras调控的PDLP激活基因的enhancer区域，而在没有Kras的情况下，Klf5与Foxa2倾向结合到一些在胰腺导管细胞高分化基因的上游。这些数据表明了，Klf5与Foxa2与Kras之间的联系，可能是通过在染色体上的再分布来实现的（图四，b）。之前的研究表明，致癌基因下游的转录因子可以通过招募细胞内已有转录因子的再定位，来促进致癌通路的激活。作者将Kras调控Klf5结合的染色质区域进行motif search，发现了AP1转录因子家族motif的富集，暗示了，AP1家族转录因子可能是Klf5受Kras的影响，在染色体上的重新定位的因素。作者利用Tet-on KrasG12D胰腺癌细胞系，在没有Kras突变基因的情况下，过表达Junb和Fosl1蛋白。与没有过表达的对照组相比较，Klf5被重新定位到受Kras调控的enhancer的区域（图四，c）。这些数据表明了，Kras对胰腺癌的发生发展的分子机制，是通过促进其下游的Junb，Fosl1转录因子，使Klf5与Foxa2（在正常的胰腺细胞里面高表达的转录因子）结合到促癌基因的enhancer区域来，进而促进下游基因的转录来实现的。
图四，a, Kras，Junb和Fosl1调控的转录组之间的GSEA分析。b, 在有无Kras条件下，Klf5, Foxa2和H3K27ac 的ChIP-seq。c,在有无Kras条件下，过表达Junb和Fosl1之后，Klf5和Foxa2的ChIP-seq。
基于上述结果，在这个研究中，作者发现了一群在ADM中表达Klf5的PDLP细胞，经过证明它们是一群高表达了促癌转录调控网络的胰腺癌前体细胞。而这种转录调控网络是Kras通过促进Junb与Fosl1在激活的enhancer区域结合，进而招募Klf5与Foxa2在此区域的结合，进而协同控制的。在该项研究中，作者首次系统地阐述了，胰腺癌前体细胞的转录组与表观遗传组信息，并阐明了Kras突变基因通过协同调控胰腺炎诱导的转录网络，来促进胰腺癌的产生与发展。为胰腺癌早期的诊断与治疗，提供了潜在的靶点和思路。
清华大学医学院Charles David组博士生李勇，博士生贺毅，以及北京协和医院医学科学研究中心彭俊雅博士为本文共同第一作者。
原文链接：
/articles/s43018-020-00134-z
参考文献：
1. Pasca, M. Roles for KRAS in Pancreatic Tumor Development and Progression.Gastroenterology144, 1220–1229 ().
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来源：BioArt
