乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒

【生产厂家】上海克隆生物高技术有限公司

【批准文号】国药准字S0029

【剂型】检测试剂盒

【规格】20人份

【医保类型】

【国家基本药物】否

【英文名】HBV DNA PCR-Fluorescence Quantitative Diagnostic Kit

【正文】

【用途】

本试剂盒采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于对临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸DNA的定量检测,本品可用于对乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。本品的检测灵敏度为500拷贝/ml，定量测定范围500～108拷贝/ml。

PCR扩增前50℃处理2分钟，利用UNG将PCR反应液中可能存在的前次扩增污染物充分降解，以排除由此引起的假阳性检测结果。

【试剂盒组成】

32人份/盒

类别

试剂名称

规格

样品

处理试剂

煮沸法

[样品处理液A]

4 ml × 1瓶

[样品处理液B]

1 ml × 1支

柱提取

[样品处理液A]

4 ml × 1瓶

[去抑制剂]

1支

[核酸提取柱]

32个 × 1袋

[样品处理液B]

14ml × 1瓶

[样品处理液C]

4 ml × 1瓶

[灭菌纯化水]

1.8 ml × 2支

PCR扩增

反应试剂

适用所有

荧光PCR仪

[PCR反应液A]

480μl × 1支 (LightCycler 360μl × 1支)

[PCR反应液B]

480μl × 1支 (LightCycler 360μl× 1支)

[PCR反应液C]

40μl × 1支

LightCycler

专用

[PCR主反应液]

350μl × 1支

[氯化镁]

150μl × 1支

[荧光杂交探针]

1支

对照试剂

[阴性对照]

250μl × 1支

[工作标准品①]

250μl × 1支 (参数见试剂盒内提示)

[工作标准品②]

250μl × 1支 (参数见试剂盒内提示)

[工作标准品③]

250μl × 1支 (参数见试剂盒内提示)

[工作标准品④]

250μl × 1支 (参数见试剂盒内提示)

【适用荧光PCR仪器】

Roche LightCycler、ABI5700、ABI7000、枫岭FTC2000、博日Line-Gene、MJ Opticon等

【自备实验器材】

经高压灭菌(121℃，30分钟)处理的0.5ml离心管及10μl、200μl带滤芯吸嘴；各种规格的加样枪；高速离心机；震荡仪；水浴或干浴设备。

【标本采集】

样品可采用血清或血浆样本，血浆采用3%枸橼酸钠抗凝，抗凝剂:血液为1:9。

【操作步骤】

1.煮沸法——适用LightCycler的操作步骤见【附件1】。

2.煮沸法——适用ABI等荧光PCR仪的操作步骤见【附件2】。

3.柱提取——LightCycler专用的操作步骤见【附件3】。

4.柱抽提——适用ABI等荧光PCR仪的操作步骤见【附件3】。

【注意事项】

1.待检新鲜血清或血浆若不及时检测,应保存于-20℃。

1.试剂盒各组份使用前请充分融化并摇匀,离心管内的试剂需离心数秒后使用。

2.PCR操作各阶段应在不同实验区域进行，包括PCR扩增试剂准备区、标本处理区及PCR扩增检测区。

4.在标本处理阶段建议使用负压超净台。

5.应穿工作服，戴一次性手套(经常替换手套)，使用一次性用品。

6.PCR操作人员应具有经验和受过培训。

7.操作过程中用到的超净台、移液器、离心机、扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或70%乙醇及紫外灯处理。

8.实验中废弃的吸嘴应弃于含10%次氯酸的废液缸中，以防止污染。

9.阴性对照、工作标准品应和待检标本平行进行操作后方可进行PCR扩增。

10.使用本试剂盒检测，请按传染病实验室检查规程操作。

11.血清标本的测定结果比血浆标本测定结果略低。

【试剂运输及储存条件】

试剂盒运输可在2～8℃环境下进行。储存时，须置-20℃保存。

【有效期】

本试剂盒有效期为12个月，在有效期内使用。

附件1:煮沸法——适用LightCycler的操作步骤

1.核酸提取(在标本处理区进行)

待测样品处理(将[阴性对照]、[工作标准品①]、[工作标准品②]、[工作标准品③]、[工作标准品④]与待测标本同步进行处理)

1.1用带滤芯吸嘴吸取100μl[样品处理液A]于0.5ml离心管中。

1.2加入100μl被测标本。

1.3盖上管盖，振荡混匀，13000rpm离心10分钟(离心时固定离心管方向)。

1.4吸弃上清(沉淀不明显，需在离心管底部沉淀对侧吸上清，应一次吸尽上清，避免搅动或碰到沉淀)。

1.5再加入25μl[样品处理液B]。

1.6振荡混匀，低速(2000rpm)离心数秒后，100℃干浴或沸水浴10分钟。

1.713000rpm离心10分钟，取上清为PCR反应模板。

(上清如不立即使用，须置-20℃保存,重新使用时需13000rpm离心10分钟。)

2.PCR试剂准备(在PCR前准备区进行)

2.1取试剂盒中[PCR反应液A]、[PCR反应液B]、[PCR反应液C]室温融化后，低速(2000rpm)离心数秒。

2.2根据待扩增样品数按[PCR反应液A]:[PCR反应液B]:[PCR反应液C]=9:8:1的比例配制PCR反应液，并分装至PCR毛细反应管中，每管18μl，将装有PCR反应液的反应管转移至标本处理区。

3.加样(在标本处理区进行)

在装有PCR反应液的毛细反应管中用带滤芯吸嘴分别加入2μl已处理好的标本(标本处理步骤1.7的上清)。盖上管盖，离心数秒后转移到扩增检测区。

4.PCR扩增检测(在扩增检测区进行)

4.1将毛细反应管放入LightCycler荧光PCR扩增仪进行扩增检测。

4.2循环参数设定:(荧光检测通道F1)

Program

Cycles

Temperature Target(℃)

Hold Time

(min:sec)

Slope

(℃/sec)

Acquisition

Mode